细胞培养污染拯救及预防方法

§ 污染是细胞培养的大敌。预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。

§ 一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。

（一）污染的类型

§ 细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。

1、细菌污染

§ 细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。

§ 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。

2、真菌污染

§ 真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

§ 培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。

§ 真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

3、支原体污染

§ 支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。

§ 培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。

                   阳性                                                  阴性

4、病毒污染

§ 组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。

§ 尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

5、非同种细胞污染

§ 由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。

§ 非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。

（二）、污染的鉴别

1、细菌、真菌污染的检测

§ （1）肉眼观察  

§ 细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到，例如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。

§ （3）接种观察  

§ 采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。

§ （2）镜下观察  

§ 在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。

§ 若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。

2、支原体污染的检测

§ （1）相差显微镜观察

§ 直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察，支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。

§ 应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。

§ （2）荧光染色法观察  

§ 用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。

A positive

§ （3）电镜检测  

§ 若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。

§ （4）培养检测  

§ 将细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基，培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。

3 、病毒的检测

§ 1) 应用电镜技术快速诊断动物病毒病

§ 2) 逆转录_聚合酶链反应RT_PCR检测病毒

（三）、污染的清除

§ 培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之；在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。

§ 若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。

一、细菌和真菌的清除

§ 1、使用抗生素

§ 抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。

§ 预防用药一般用双抗生素，污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。

（二）、支原体的清除

§ １、用MRA处理

§ 用MRA（Mycoplasma Removal Agent）处理细胞，每4天换一次液,连续处理15天以确保细胞纯洁健康．

§ 效果好．

§ 2、用清洗纯化法清除支原体污染的方法

§ 细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤

§ 其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限.

§ 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。

§ 3、药物辅助加温处理

§ 先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。

４、使用支原体特异性血清

§ 用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。

§ 但此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。

（四）、污染的预防

§ 预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。

§ 一般预防可从以下几方面着手：

1、添加抗生素

2、从物品、用品消毒灭菌着手

§ 细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。

§ 操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。

3、从操作者做起

§ （1）进无菌室前要用肥皂洗手，按规定穿隔离衣。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。

§ （2）操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。

§ （3）操作时要常更换吸管，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕用消毒水浸泡的纱布擦台面。

4、防止细胞交叉污染

§ 在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分。

§ 在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。

§ 细胞一旦购置或从别处引入，均应及早留种冻存，一旦发生污染可重新复苏培养。

５、无菌室的彻底消毒

§ 1) 0.1%新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室；

§ 2）甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂菌，其水溶液和气休对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。