1 产物的最优条件是什么？ 
最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数要求，为提高连接效率，需4℃过夜。 

2  产物是否需要用凝胶纯化？ 
如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。 

3  如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？ 
A）涂布未转化的感受态细胞。 
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。 
B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。 
例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板的总量。 
铺板的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng ，用SOC稀释到1000u后含10 ng，用1/10铺板，共用1 ng 。转化率为： 
1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng  ug=10（6次方）cfu/ ug 
转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞 
如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。 
C）如用pGEM-T正对照，或产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 连接酶替换。 
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。

4  对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？ 
A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。 
B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。 
C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，必需重新纯化。 
D）带有修复功能的耐热聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq 聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。 
E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞