阴性对照出现阳性结果

试剂/样品污染

试剂和样品可能被污染，或者由于孔之间的溅洒交叉污染。使用新鲜试剂，小心操作移液器。

夹心ELISA - 检测抗体与包被抗体反应

确定使用的是正确的包被抗体和检测抗体,他们之间不会互相反应。

酶标板洗板不彻底

用洗液充满板孔确保每孔被充分洗涤，洗板前确保所有的剩余抗体溶液被倒净。

抗体量过多导致非特异结合

根据推荐用量使用抗体。尽量使用较少的抗体。

酶标板整体背景高

结合反应太强或时间过长

检查底物的稀释，使用建议的稀释度。当酶标板显色足够进行吸光度读取时立即用终止液终止反应。

底物溶液或终止液不是新配制

使用新配制的底物溶液。终止液应该是清亮的（如果它变黄，这是被污染的标志，需要重新配制）。

没有终止反应

如果底物反应没有被终止，颜色会继续变化。

酶标板在酶标仪读板前放置时间过长

颜色会继续变化（尽管加了终止液，依然会以很慢的速度变化)。

试验器皿污染

确保试剂是新配的并且使用的是清洁的玻璃器

底物孵育过程没有避光

底物孵育应该在避光条件下进行。

孵育温度过高

抗体在适宜的温度下有最佳的结合活性。确保孵育在正确的温度下进行，孵育箱要设定好适宜的温度并正常工作。孵育温度可能需要一些优化。

抗体非特异性结合

确保进行了封闭并使用的是恰当的封闭液。jnh官网建议使用 5-10% 的与二抗同种动物来源的血清或牛血清。

确保板孔经过预处理以防止非特异结合。使用亲和力强、纯度高的抗体，最好经过了预吸收。

请检查针对“阴性对照出现阳性结果”的建议

吸光度数值低

使用的样品中没有显示出靶蛋白或者靶蛋白显示的水平低

检查靶蛋白表达系统，确保它在您的样品中被表达出来。如果靶蛋白的表达水平低，需要增加样品使用量，或者您可能需要选择

一个更灵敏 的测定方法。确保您使用的是没有超出测定方法检测范围的阳性对照。

抗体不足

确定使用的是建议的抗体量，为了使结果更好可能需要增加抗体的浓度。

底物溶液不是新鲜配制或成分有误

使用前新鲜配制底物溶液。确保储备液在有效期内并且被正确储存，使用的浓度也是正确的。确保试剂按正确的浓度使用。

试剂不是新鲜配制或pH值有误

确保试剂配制正确并在有效期内。

孵育时间不够长

如果建议了孵育时间，确保按推荐的时间长度孵育抗体。为了使结果更理想，孵育时间可能需要增加。

孵育温度太低

抗体在适宜的温度下有最佳的结合活性，确保孵育是在正确的温度下进行，孵育箱要设定好适宜的温度并正常工作。孵育温度可能需要一些优化。确保所有的试剂在使用前是室温。

未加终止液

加入终止液可以增加显色反应的强度，也能固定反应最终的颜色。

吸光度数值高

样品和/或阳性对照吸光度数值高。吸光度没有按样品在板子上的稀释度递减。

样品或阳性对照的浓度过高，超出了试验方法检测的范围。重新设置试验方法或者在加样前通过稀释降低样品和对照的浓度，在处理结果计 算浓度时考虑到所作的稀释。

酶标板上吸光度不规律

孵育时酶标板叠在一起酶标板叠在一起使板子每个孔的温度不能平衡一致，请避免堆叠。

吸液不一致

确保移液器使用正确并经过校准、确保枪头插得足够紧密。板子稀释时要特别仔细，注意确保每个枪头都吸上和排出正确量的液体，这对平 行样品结果的一致性有很大影响。

抗体稀释液/试剂未混匀

为保证板子所有孔的浓度一致，确保所有的试剂和样品在加到板子上以前都被混合均匀。

板孔变干涸

确保所有孵育期间酶标板始终被盖好。放置一个潮湿的水盘(保持清洁，无菌水)在孵育箱的底部。

洗板不充分

这将导致一些孔没有其他孔清洗的好，残留不同量的未结合的抗体，使后面的结果产生不一致。

酶标板底部不净影响吸光度读取

读板前小心清洁酶标板底部。

颜色变化过慢

酶标板未处于恰当的温度中确保酶标板处于室温，试剂在使用前也处于室温。

结合能力太弱

使用前新鲜配制底物溶液。确保储备液在有效期内并且被正确储存，使用的浓度也是正确的。确保试剂按正确的浓度使用。

溶液污染

例如象叠氮化钠和过氧化物酶这类污染物的存在，将会影响底物的反应，避免使用含有这些防腐剂的试剂。