JC-1 (Powder) 线粒体膜电位荧光探针（粉末）

产品简介：

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电△Ψm位的理想荧光探针。JC-1染料以电势依赖性的方式积聚在线粒体内，可以用来检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光（Ex=514 nm, Em=529 nm）。

JC-1不仅可用于定性检测，因颜色的变化可以非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。也可以用于定量检测，因线粒体的去极化程度可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。观察时，只需使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。
    本品以冻干粉形式提供，CAS NO.3520-43-2 ，细胞培养级。用于检测细胞的线粒体膜电位时常用的浓度范围为1～20 µg/ml，对于很多细胞适宜采用的工作浓度为10 µg/ml。

产品特性

1） CAS NO：3520-43-2 

2） 化学名：5,5‘,6,6’-Tetrachloro-1,1‘,3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide

3） 分子式：C₂₅H₂₇Cl₄IN₄

4） 分子量：652.23 g/mol

5）  纯度：＞95%（HPLC）

6）  外观：红褐色粉末

7）  溶解性：溶于DMSO、DMF，几乎不溶于水

8）  Ex/Em：单体形式（monomer form）：Ex=514 nm, Em=529 nm；

              聚合物形式（J-aggregate form）：Ex=585 nm, Em=590 nm；

保存条件: 

-20℃干燥避光保存，2年有效。

产品使用：

1. 染色工作液制备

1）JC-1储存液制备：将JC-1粉末室温回温20min左右，直接加1ml无水DMSO到5mg粉末，颠倒混匀，使其充分溶解后，即得到5mg/ml的储存液。溶液单次用量分装存于-20℃，避光干燥且避免反复冻融。

2）JC-1工作液制备：将冻存的储存液置于室温充分融化，之后用缓冲液或者预热的培养基直接稀释储存液（5 mg/ml）到需要的工作浓度，边震荡边稀释，充分混匀。为了去除任何不溶颗粒，建议13,000 x g离心工作液1 min，小心吸取上清转移到新的管子内。整个过程要避光操作。

【注意】：因JC-1不溶于水，很可能在稀释到工作液的过程中形成聚集颗粒，建议细胞染色前用离心或者过滤的方法去除这些颗粒后再使用。

2. JC-1染色步骤（流式细胞仪）

1）于6-，12或24-孔板上进行细胞铺板，调整密度为5×10⁵cells/ml。37℃，5% CO₂培养箱培养过夜。选择合适的化合物根据特定的步骤进行凋亡诱导。【注意】：进行凋亡诱导时的细胞密度建议不超过1×10⁶cells/ml，也可根据自己的细胞类型培养至合适的密度。

2）取0.5 ml细胞悬液至无菌的离心管内；

3）室温条件400 x g离心5 min；吸掉上清。

4）用0.5 ml JC-1工作液重悬细胞，于37℃，5% CO₂培养箱孵育15-30 min；【注意】：一般情况，15 min足以进行充分的染色。

5）室温条件400 x g离心5 min；吸掉上清；

6）用2 ml细胞培养液或者缓冲液重悬细胞，之后室温条件400 x g离心5 min；吸掉上清；

7）重复步骤6）；

8）用0.5 ml新鲜培养液或者缓冲液重悬细胞，即可进行后续的流式分析。【注意】：请马上进行流式定量分析，此细节很重要。

数据分析：含有红色JC-1聚集物的健康细胞线粒体用FL2通道检测；含有绿色JC-1单体的凋亡或不健康细胞用FL1（FITC）通道检测。

3. JC-1染色步骤（荧光显微镜）

A、悬浮细胞

1）-6）同上JC-1染色步骤（流式细胞仪）；

7）用0.3 ml缓冲液重悬细胞，即可进行荧光显微镜检测。【注意】：请马上进行荧光显微分析，此细节重要。

 数据分析：

使用可同时检测FITC/TRITC或者FITC/Texas RedTM的双带带通滤波器进行检测。健康细胞因JC-1聚集后线粒体呈红色，最大发射波长为590 nm。而凋亡/坏死细胞内的JC-1以单体形式存在，线粒体呈绿色，最大发射波长为530 nm。

B、贴壁细胞

1）培养皿内用盖玻片进行细胞爬片或者细胞培养在腔室玻片（chamber slide）上。选择合适的化合物根据特定的步骤进行凋亡诱导。

2）染色前开始配制JC-1工作液，配制步骤见上。

3）吸掉细胞培养液，然后加入足够覆盖所有细胞的JC-1工作液。于37℃，5% CO₂培养箱孵育15-30 min；【注意】：一般情况，15 min足以进行充分的染色。

4）吸掉培养液，然后用合适的缓冲液清洗细胞2次。

5）加入2ml细胞培养液（培养液可含血清和酚红）或者PBS缓冲液，于荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察。数据分析同A.悬浮细胞。

4. JC-1染色步骤（荧光酶标仪）

1）-7）同上JC-1染色步骤（流式细胞仪）；

8）用0.3 ml缓冲液重悬细胞；然后按照每孔0.1 ml的量将染色好的细胞转移到黑色的96孔板内，即可进行荧光酶标板分析。【注意】：请马上进行荧光显微分析，此细节重要。

 数据分析：

健康细胞，JC-1单体聚集形成聚合物，线粒体呈现强烈的红色荧光（激发波长550 nm，发射波长600 nm）。而凋亡或坏死细胞内JC-1以单体形式存在，线粒体呈强烈的绿色荧光（激发波长485 nm,发射波长535nm）。之后计算红色荧光信号与绿色荧光信号的比值，用来判断细胞健康程度。

注意事项：

1.      JC-1是光敏感性的，所有染色步骤的操作过程中避免强光接触。

2.      JC-1染色完成后，立即进行后续的结果分析非常必要。

3.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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