Fluo-3, AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针，标准纯（90%）

【温馨提示】：见我司整理的钙离子载体/探针（Calcium ionophores/indicators）产品专题。

【务必注意】：初次使用离子探针的用户，强烈建议配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 细胞培养级（NBS2009-1g）一起使用，以提高探针的水溶性和胞内加载性。 

产品简介：

Fluo-3是一种常用的可见光激发波长Ca²⁺荧光探针，具有较高的Ca²⁺捕获能力，通过荧光强度的变化直接反映Ca²⁺信号的动力学变化。当Fluo-3以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但一旦与Ca²⁺结合即可产生很强的荧光，荧光信号增强60~80倍，此时的最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。可通过激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等来检测胞内钙离子水平的变化。

Fluo-3, AM是Fluo-3的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Fluo-3，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。本品以冻干粉的形式提供，使用时只需经无水DMSO充分溶解，配置成2~5mM的储存液，并依据具体实验和相关文献资料调整到需要的工作浓度即可。

产品特性：

1）CAS NO：121714-22-5

2）同义名：Fluo-3, Acetoxymethyl Ester

3）分子式：C51H50Cl2N2O23

4）分子量：1129.85

5）纯度：≥95% (HPLC)

6）解离常数（Kd）：390nM (Ca²⁺)

7）最大激发/发射波长：506/526 nm

8）溶解性：溶于DMSO（2-5mM）

9）化学结构图：

保存条件: 

-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。

产品使用： （针对人T细胞Ca²⁺浓度检测）

A，  试剂准备

1）配制Pluronic F-127母液

100mg Pluronic F-127粉末（货号：NBS2009）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

2）Hanks Balanced Salt Solution（HBSS），w/o Ca²⁺，Mg²⁺

3）HEPES Buffer Saline

配方：10mM HEPES，1mM Na₂HPO₄，137mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl₂，0.5mM MgCl₂，5mM glucose，0.1% BSA，pH 7.4

B，  操作步骤

1）用无水DMSO溶解Fluo-3, AM配制成2-5mM的储存液，或将已配好的Fluo-3, AM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向50µg Fluo-3,AM中加入11µl无水DMSO）。

2） 向Fluo-3, AM+DMSO溶液中加入等体积的20% Pluronic F-127溶液，Pluronic F-127可以防止Fluo-3, AM在HBSS中聚合并促使探针更好进入细胞。【注】：Pluronic F-127可降低Fluo-3, AM的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议将其加入储存液长期保存。

3）用HBSS稀释Fluo-3, AM溶液，制备2-5µM的Fluo-3, AM工作液。【注】：推荐该探针加载浓度在4-5µM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低浓度探针。

4）  将Fluo-3, AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。37℃孵育20min。

5）  加入5倍体积的含有1% FBS的HBSS，继续孵育40min。

6）  用HEPES Buffer Saline洗涤细胞3次，然后用HEPES Buffer Saline使细胞重悬，制成1×10⁵cells/ml的溶液。

7）  37℃孵育10min，之后用流式细胞仪或者共聚焦显微镜进行荧光钙离子检测。最大激发波长506nm，最大发射波长526nm。

注意事项：

1.      荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

3.      Fluo-3, AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可在20-25℃温育片刻至全部融解后使用。

4.      基于BAPTA结构的钙离子指示剂比如Fluo-3，Fluo-4，能够结合很多重金属阳离子（比如：Mn²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺）且实质上亲和力高于Ca²⁺。因此，由于这些重金属离子存在对钙测定的干扰可使用重金属螯合剂-TPEN（货号：NBS5877）来控制。

5.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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