Fluo-8, AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针，超级纯

【温馨提示】：见我司整理的钙离子载体/探针（Calcium ionophores/indicators）产品专题。

【务必注意】：初次使用离子探针的用户，强烈建议配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 细胞培养级（NBS2009-1g）一起使用，以提高探针的水溶性和胞内加载性。 

产品简介：

Fluo-8，是目前最亮的可见光激发波长Ca²⁺荧光探针，其荧光强度比Fluo-4强两倍，比Fluo-3强四倍。Fluo-8具中等程度的Ca²⁺亲和力，几乎接近Fluo-3，Fluo-4（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM），使用上几乎同Fluo-3和Fluo-4。

Fluo-8不仅维持Fluo-3，Fluo-4便捷的光谱检测特性，与Ca²⁺结合后的最大激发波长为490nm，最大发射波长为514nm。而且具有改善的细胞载入和Ca²⁺响应能力。Fluo-8加载具较弱的温度依赖性，在室温或37℃孵育皆染色良好，不像Fluo-3，Fluo-4严格要求在37℃孵育，此特征使其更适用于HTS高通量筛选实验。Fluo-8应用广泛，与许多细胞系和靶向样本兼容，不会受配体或靶标本身信号干扰。Fluo-8可通过激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光显微镜等来检测胞内钙离子水平的变化。

Fluo-8, AM是Fluo-8的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Fluo-8，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。本品以50μg小包装的冻干粉形式供货，用于细胞内Ca²⁺水平检测时，常用浓度为1-5μM。

基本特性：

1）同义名：Fluo-8, Acetoxymethyl Ester;Fluo-2, AM; Fluo-2 Medium Affinity, Acetoxymethyl Ester;

2）化学名：Bis(acetoxymethyl) 2,2'-((4-(6-(acetoxymethoxy)-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-2-(2-(bis(2-acetoxymethoxy)-2-oxoethyl)amino)phenoxy)ethoxy)phenyl)azanediyl)diacetate

3）分子式：C50H50N2O23

4）分子量：1046.93

5）最大激发/发射波长：490/514 nm（Ca²⁺结合）

6）溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

7）化学结构图：

保存条件: 

-20℃干燥避光保存，有效期一年。

产品使用： 【注意】以下使用方法仅用作参考，可根据具体的实验条件做出调整。

A、试剂准备

1. 配制Pluronic F-127母液：称取100mg Pluronic F-127粉末（货号：NBS2009）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

2. HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3)或者其他生理缓冲液

B，操作步骤

1. 用无水DMSO溶解Fluo-8, AM配制成1-5mM的储存液，或将已配好的Fluo-8, AM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向50µg Fluo-8,AM中加入11.9µl无水DMSO）。

2. 用HHBS或其他生理缓冲液将Fluo-8, AM+DMSO储存液稀释到1-10µM的工作液，提前加入适量的20% Pluronic F-127溶液，使其终浓度为0.02%。

【注①】：Fluo-8, AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4-5µM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

【注②】：Fluo-8, AM工作液需现配现用，避免反复冻存。

【注③】：Pluronic F-127可以防止Fluo-8, AM在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低Fluo-8, AM的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存。

3.【可选】如果细胞内含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮储存液相当偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH。

4. 将准备好的Fluo-8, AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。37℃或者室温孵育20-60min。

【注①】：关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果；如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。

【注②】：降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。

5. 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如2.5mM丙磺酸的缓冲液）替换，以去除多余探针。

6. 用适当的仪器如激光共聚焦、流式细胞仪、荧光酶标仪，以及波长Ex/Em=490/520 nm来进行检测。

【注①】：Fluo-8, AM进入胞内后，经酯酶降解形成Fluo-8，并不是以共价结合的形式滞留在细胞质内。因此不可对加载染料的活细胞进行固定处理，再进行Ca²⁺水平检测。

注意事项：

1.      荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

3.      Fluo-8, AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可在20-25℃温育片刻至全部融解后使用。

4.      Fluo-8, AM第一次使用，建议储存液现配现用，分装成单次用量，严格做到≤-20℃密封干燥冻存，以防止受潮。为了保证良好的实验效果，尽量在短时间内使用。

5.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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