Rhod-5N AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针

【务必注意】：初次使用离子探针的用户，强烈建议配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 细胞培养级（NBS2009-1g）一起使用，以提高探针的水溶性和胞内加载性。 

产品简介：

与其它基于BAPTA结构的指示剂相比，Rhod-5N显示出更低的钙离子亲和力（Kd=~320 µM），适用于浓度在10µM~1mM的钙离子测定。与母本Rhod-2指示剂类似，Rhod-5N在不含二价阳离子的情况下基本无荧光，一旦与钙离子结合后，呈现出显著的荧光增加，光谱基本无迁移。低亲和钙离子指示剂特别适合于具高浓度钙离子的细胞区室研究，比如：内质网，在这种区室内高亲和探针对腔室钙水平变化不敏感。

Rhod-5N AM是Rhod-5N的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Rhod-5N，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。本品以冻干粉的形式提供，使用时只需经无水DMSO充分溶解，配置成2~5mM的储存液，并依据具体实验和相关文献资料调整到需要的工作浓度即可。

产品特性

1）  化学名：N-(9-(4-(bis(2-(acetoxymethoxy)-2-oxoethyl)amino)-3-(2-(2-(bis(2-(acetoxymethoxy)-2-oxoethyl) amino)-5-nitrophenoxy)ethoxy)phenyl)-6-(dimethylamino)-3H-xanthen-3-ylidene)-N-methylmethanaminium bromide

2）  同义名：Rhod-5N, Acetoxymethyl Ester

3）  分子式：C51H56N5O11Br

4）  分子量：1154.92

5）  Ex/Em（Ca²⁺结合）：551/576 nm

6）  Kd（Ca²⁺结合，不含镁离子的缓冲液）：~320 µM

7）  溶解性：溶于DMSO（2~5mM）

保存条件: 

-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。

产品使用：

A，试剂准备

1）配制Pluronic F-127母液：称取100mg Pluronic F-127粉末（货号：NBS2009-1g）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

2）HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.2)或者其他生理缓冲液

B，操作步骤

1） 用无水DMSO溶解Rhod-5NAM配制成2-5mM的储存液，或将已配好的Rhod-5NAM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向1mgRhod-5NAM中加入216.4 µl无水DMSO）。准备Rhod-5NAM工作液之前，有时需要往Rhod-5NAM储存液中加入适量的20% Pluronic F-127溶液，以增强AM探针的水溶性。

【注①】：Rhod-5NAM染色工作液制备前，添加适量体积20% Pluronic F-127溶液到Rhod-5NAM + DMSO储存液，从而使Pluronic F-127的最终工作浓度约为0.02%。

【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探针在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低AM探针的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存。

2） 用HHBS或其他生理缓冲液将Rhod-5NAM +DMSO储存液稀释到1-10µM的工作液。

【注①】：Rhod-5NAM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4-5µM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

【注②】：Rhod-5NAM工作液需现配现用，避免反复冻存。

3）【可选】如果细胞内含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮储存液相当偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH。

4）将准备好的Rhod-5NAM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。37℃孵育20min-2h。

5）吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如1 mM丙磺舒的缓冲液）清洗细胞1~2次，以去除残留探针。

6）室温再孵育30min以保证细胞内AM的完全去酯化。

7）用适当的仪器如激光共聚焦、流式细胞仪、荧光酶标仪，以及波长Ex/Em=551/576 nm来进行检测。

注意事项：

1.      荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

3.      Rhod-5N, AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可在20-25℃温育片刻至全部融解后使用。

4.      Rhod-5N, AM第一次使用，建议储存液现配现用，分装成单次用量，严格做到≤-20℃密封干燥冻存，以防止受潮。为了保证良好的实验效果，尽量在短时间内使用。

5.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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