Fura-FF AM , Cell Permeant 钙离子荧光探针

【务必注意】：初次使用离子探针的用户，强烈建议配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 细胞培养级（NBS2009-1g）一起使用，以提高探针的水溶性和胞内加载性。 

产品简介：

Fura-FF是钙离子指示剂Fura-2（货号：NBS7642，货号：NBS7663）的二氟化衍生物。与Fura-2不同，Fura-FF对镁离子（Mg²⁺）基本不敏感，减少了该离子带来的测定干扰。Fura-FF比Fura-2，呈现出更高的钙离子解离常数（K_d=6μM versus 0.14μM）。然而，两者的光谱特征类似，体系不含钙离子时激发和发射波长是365/514nm，当体系含高浓度钙离子时激发和发射波长迁移到339/507nm。低亲和钙离子染料，包括：Fura-FF，更倾向于研究含高浓度钙离子的细胞器（比如：线粒体），或具相对较低钙离子缓冲能力的细胞系统，比如：神经元树突和神经树突棘。
  Fura-FF AM是Fura-FF的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Fura-FF，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。

产品特性：

1）CAS NO：348079-12-9

2）化学名：2-[6-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-5-[2-[6-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl] amino]-2,3-difluorophenoxy]ethoxy]-2-benzofuranyl]-5-oxazolecarboxylic acid(acetyloxy)methyl ester

3）同义名：Fura-2FF, AM; Fura-FF, Acetoxymethyl Ester;

4）分子式：C₄₃H₄₃F₂N₃O₂₄

6）最大激发/发射波长：365/514 nm（Ca²⁺-free），339/507 nm（high Ca²⁺-bound）

7）溶解性：溶于DMSO（5mM）

8）化学结构图：

保存条件: 

-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。 

产品使用：

A， 试剂准备

1） 配制Pluronic F-127母液： 称取100mg  Pluronic F-127粉末（货号：NBS2009-1g）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

2） HHBS Buffer (1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.2-7.4) 或者其他生理缓冲液

1） 用无水DMSO溶解Fura-FF AM配制成2-5mM的储存液，或将已配好的Fura-FF AM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向50µg Fura-FF AM中加入12.2µl 无水DMSO）。准备Fura-FF AM工作液之前，有时需要往Fura-FF AM储存液中加入适量的10% Pluronic F-127溶液，以增强AM探针的水溶性。

【注①】：Fura-FF AM染色工作液制备前，添加一定体积的10% Pluronic F-127溶液到Fura-FF AM + DMSO储存液，从而使Pluronic F-127的最终工作浓度约为0.02%。

【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探针在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低AM探针的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存。

2） 用HHBS或其他生理缓冲液将 Fura-FF AM+DMSO储存液稀释到1-20µM的工作液。

【注①】：Fura-FF AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为2-5µM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

【注②】：Fura-FF AM工作液需现配现用，避免反复冻存。

3）【可选】如果细胞内（比如CHO细胞）含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone， 0.1-0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露水平。

4） 将准备好的Fura-FF AM染色工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。室温或37℃孵育20-120min。

【注①】：若使用含血清的培养基，血清内酯酶会降解AM，从而降低Fura-FF AM加载效果。而含酚红培养基会使本底值略偏高，建议加入染色工作液前，对细胞清洗2~3次。

【注②】：关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果；如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。

【注③】：降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如1mM 丙磺舒的缓冲液）清洗细胞1~2次，以去除残留探针。

6） 室温再孵育30min以保证细胞内AM的完全去酯化。

7） 用合适的激发/发射波长来检测荧光。

注意事项：

1.      荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

3.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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