BCFL AM (Superior replacement for BCECF AM) pH荧光探针

【务必注意】：初次使用离子探针的用户，强烈建议配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 细胞培养级（NBS2009-1g）一起使用，以提高探针的水溶性和胞内加载性。 

产品简介：

BCFL AM是一种细胞膜渗透性的荧光探针，用来测定相对的胞内pH变化。是常用的比率型pH探针-BCECF（2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)- Carboxyfluorescein）的优越替代物。与BCECF不同（至少由三种异构体构成的一种复合物，不同异构体之间的比率因批次而异），BCFL是单一异构体，具有更优秀的结果重复性。BCFL具有与BCECF相同的光谱反应（单波长测定λex/λem=490/535nm；或比率测定λex/λem=505/ 535nm和λex/λem=430/535nm）（光谱特征见附录I）。BCFL AM表现出pH依赖的双激发性，pKa~7.0，以及一个激发交点（454nm）。BCFL AM的比率型成像使得胞内pH测定基本不受几种可变因素的影响，包括染料浓度、光径、细胞泄露和光漂白率。

产品特性：

1）  同义名：BCFLAM ester;BCFLAcetoxymethyl Ester;

2）  分子量：~600

3）  溶解性：溶于DMSO

4）  Ex/Em：503/528nm

保存条件: 

-20℃避光干燥保存，至少1年有效。

产品使用：

A、试剂准备

1. 10% Pluronic F-127母液配制【可选】

a）将1g Pluronic F-127（货号：NBS2009-1g）溶于10ml去离子水，配制成10%（w/v）母液。

b）溶解过程中于40~50℃内加热10% Pluronic F-127母液30min，使其完全溶解。

c）10% Pluronic F-127母液室温保存，高达6个月稳定，不要冻存。

2. HHBS Buffer或其他生理缓冲液

3. 丙磺舒（货号：NBS2007-1g）或水溶性丙磺舒（货号：NBS2008-154mg）【可选】

B、操作步骤

【注意】：以下实验步骤中用到非离子表面活性剂Pluronic F-127和有机阴离子转运抑制剂丙磺舒（Probenecid），这两种试剂虽然都是非必需的，但强力推荐使用。

1. 制备BCFLAM母液：于实验前，将低温保存的BCFLAM粉末（Mw：~600）置于室温回温至少20min。低速离心后加入高质量无水DMSO配制成10~20mM母液。比如：1mgBCFLAM粉末加入166μl DMSO充分溶解，混匀后即得到10mM母液。多余的母液根据单次用量分装，避光冻存，约3个月稳定

2. 用HHBS或其他的生理缓冲液制备2×工作液（含10μMBCFLAM和0.08%Pluronic F-127），比如，在合适的管子内混合6.4μlBCFLAM（10mM储存液）和51.2μl 10%Pluronic F-127。之后，添加HHBS或其他生理缓冲液直到总体积为6.4ml。

【注意】：对于大部分的细胞系，建议BCFLAM的工作浓度为4~5μM。Pluronic F-127的终浓度建议为0.02~0.04%。

3. 吸取100μl 2×工作液到含100μl细胞培养基的培养孔内，混匀，使得BCFLAM的终浓度为5μM和Pluronic F-127的终浓度为0.04%。

4. 置于37℃孵育30~60min。之后置于室温孵育30min。

5. 吸走200μl染色液，之后重新加入含1mM丙磺舒的HHBS Buffer或其他生理缓冲液。

6. 添加化合物到检测孔内。之后通过荧光检测来进行pH分析。

【单波长检测：Ex/Em=490/535nm（cutoff=515nm）；或比率测定

Ex/Em=505/535nm和430/535nm（cutoff=515nm）】

注意事项：

1.      荧光染料都存在淬灭问题，操作或保存过程中尽量避光，减缓荧光淬灭。

2.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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