荧光素-5-马来酰亚胺（巯基染料）

Fluorescein-5-maleimide (Thiol Dye)

产品简介：

荧光素-5-马来酰亚胺（Fluorescein-5-maleimide）是一种活化的荧光分子（Ex/Em=494/518nm），能非常容易的将荧光素连接到蛋白上。马来酰亚胺基团在pH 7的最佳体系内与半胱氨酸侧链上的巯基基团反应，形成一稳定的硫醚键。马来酰亚胺基团在pH 7时与游离巯基反应活性比胺基强~1000倍。而在pH＞7.5与伯胺的反应活性提高，且会发生马来酰亚胺基团水解现象。荧光素-5-马来酰亚胺能用来标记蛋白，用于检测构象变化，多亚基复合物的组装和配基结合过程。

产品特性：

1） CAS NO：75350-46-8

2） 化学名：1-(3',6'-Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthen]-5-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione

3） 同义名：5-Maleimido-fluorescein; 5-MF; N-(5-Fluoresceinyl)maleimide; 5-马来酰亚胺荧光素；

4） 分子式：C24H13NO7

5） 分子量：427.37

6） 纯度：＞97%

7） Ex/Em：494/518nm

8） 外观：浅橘色至深橘色和浅红色至深红色粉末

9） 溶解性：溶于DMSO、DMF

10）反应基团：马来酰亚胺，与巯基反应（pH 6.5-7.5）

11）化学结构图：

保存条件: 

-20℃避光干燥保存，2年有效。

产品使用：【仅做参考】需根据具体应用来优化以下标记步骤。

A、 标记蛋白

1） 于20mM 磷酸钠缓冲液，150mM NaCl，pH 7.2或其他适合的缓冲液（pH 6.5-7.5）内准备含巯基样品。为了预防金属催化生成二硫键，体系内加入终浓度5-10mM的EDTA。

2） 往样品内加入摩尔量远高的荧光素-5-马来酰亚胺。通常情况，使用25倍高的摩尔比能得到理想结果。【注意】：荧光素-5-马来酰亚胺能直接加入水溶性溶液（高达1mM浓度）或首先溶解在DMF（10mM）在加入蛋白溶液中。

3） 进行偶联反应，室温2h或4℃过夜。

4） 用截留分子量（MWCO）为10 kD的脱盐柱或透析袋来去除未结合的荧光素。

5） 将偶联好的蛋白或多肽避光保存在4℃，稳定保存高达一个月。或按照单次用量分装，保存在-20℃。

B、 计算标记效率

【注意】：为了得到最佳的结果和精确测定标记率（F/P值），需完全去除未反应的荧光素。有必要稀释少量脱盐或透析样本。

1） 使用1cm比色皿，测定标记蛋白在280nm和495nm处的吸光值。

2） 计算蛋白浓度。

ε=蛋白摩尔吸光系数（比如，IgG的摩尔吸光系数~210,000 M-1cm-1）

Amax=A495

CF=校正系数=A280/Amax=0.3000

×稀释倍数

3） 计算标记效率

ε´=荧光素摩尔吸光系数：68,000 M-1cm-1

摩尔荧光素/摩尔蛋白= × 稀释倍数

注意事项：

1.      马来酰亚胺对湿度很敏感。需将本品保存在-20℃，保持干燥。开盖前一定要将本品放到室温回温，以避免产品受潮而凝结成团。

2.      使用前才配制试剂。不可将试剂保存在水溶液内。

3.      用荧光素-5-马来酰亚胺标记的分子必须含有游离的巯基（-SH）。某些含巯基分子在溶液中可能被氧化，形成二硫键，从而不能与马来酰亚胺反应。二硫键可被还原生成游离巯基。还原后，大部分的还原剂必须在偶联反应前去除。

4.      偶联反应体系内不要引入含巯基组分，因其会与马来酰亚胺反应，进而抑制和降低目的分子的连接率。

5.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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