DAF-FM DA 一氧化氮（NO）荧光探针（固体粉末）

产品简介：

DAF-FM DA，也称为DAF-FM Diacetate，或4-Amino-5-Methylamino-2',7'

-Difluorofluorescein Diacetate，是新一代用于检测和定量一氧化氮（Nitric oxide，NO）的荧光探针。具有细胞膜渗透性，无荧光。一旦进入细胞后，被细胞内的酯酶催化形成不具有膜渗透性的DAF-FM。DAF-FM本身仅有弱荧光，但和NO反应后可产生强烈荧光，最大激发波长为495nm，最大发射波长为515nm。任何可以检测荧光素的仪器都能检测，包括流式细胞仪、荧光显微镜、荧光酶标板和荧光计。

    与传统的NO荧光探针—DAF-2 DA相比，DAF-FM DA具有以下重要优势：a）DAF-FM-NO加合物的光谱特性在pH 5.5以上不受pH影响；b）DAF-FM-NO加合物具有更显著的光稳定性，意味其提供更多的时间来捕捉图像；c）DAF-FM对NO的检测灵敏度更高，前者的检测下限~3nM；而DAF-2的检测下限~5nM。

本品以固体粉末形式提供，需用无水的DMSO溶解，用合适的生理缓冲液或新鲜培养基（不含血清和酚红）稀释到相应的工作浓度即可，建议起始工作浓度范围是1-10μM。

产品特性：

1） CAS NO.：254109-22-3

2） 化学名：3',6'-bis(acetyloxy)-4-amino-2',7'-difluoro-5-(methylamino)-spiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H] xanthen]-3-one

3） 英文同义名：DAF-FM Diacetate; 4-Amino-5-Methylamino-2',7'-Difluorofluorescein Diacetate; 3-Amino, 4- aminomethyl-2ʹ,7ʹ-difluorofluorescein Diacetate; Diaminofluorescein-FM diacetate;

4） 中文同义名：DAF-FM二乙酸盐；二氨基荧光素-FM二乙酸盐；4-氨基-5-甲氨基-2',7'-二氟荧光素二乙酸盐；3-氨基, 4-氨甲基-2ʹ,7ʹ-二氟荧光素二乙酸盐；

5） 分子式：C25H18F2N2O7

6） 分子量：496.42

7） 纯度：≥98%（HPLC）

8） 外观：无色至淡黄色溶液

9） Ex/Em：~495/515 nm (DAF-FM)

10）化学结构图：

保存条件: 

-20℃避光干燥保存，1年有效。

产品使用：

一、 工作液制备

取用50ug DAF-FM DA加入新鲜无水的DMSO 20.1442 μL溶解至浓度为5mM， 用合适的生理缓冲液或新鲜培养基（不含血清和酚红）稀释到相应的工作浓度即可，探针的推荐使用浓度为1-10µM，初次使用需根据自身实验体系来进行加载浓度。比如取5μl DAF-FM DA(5mM)按照1：1000的比例稀释到5ml DAF-FM DA(5μM)工作液，充分混匀。

【注意】工作液必须现配现用，实验结束后需丢弃多余探针。由于染料在水溶液中更容易氧化分解，为此，请尽快用完。

【注意】探针的最佳工作浓度需根据自身的细胞类型或实验条件来摸索，或参考文献。一般情况下，在保证获得足量荧光信号的前提下，尽量选择最小浓度的探针，这样可尽量减少酯的水解副产物如甲醛和乙酸的富集。

二、 探针装载

对于刺激时间较短（通常为2h以内）的细胞，先装载探针，后用适当的阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长（通常为6h以上）的细胞，先用适当的阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

2.1 探针原位装载（仅适用于贴壁细胞）

a）去除细胞培养液，加入适当体积准备好的DAF-FM DA工作液（比如按1：1000倍稀释后的工作液）。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入工作液体积为1ml。

b）37℃孵育20min。

c）用PBS, pH7.4洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA。

2.2 收集细胞后探针装载

a）细胞收集后，用适当体积准备好的DAF-FM DA工作液（比如按1：1000倍稀释后的工作液）重悬细胞，使得细胞浓度为一百万至二千万/毫升。

b）37℃孵育20min。以上操作可以在离心管内进行。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。c）用PBS, pH7.4洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA。

d）直接用适当的阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后再刺激细胞。

三、 荧光检测

3.1对于原位装载探针的样品：可以用激光共聚焦显微镜直接观察（用普通的荧光显微镜观察效果相对较差），或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

3.2 对于收集细胞后装载探针的样品：可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。

3.3 参数设置：使用495nm激发波长，515nm发射波长，实时、逐时间点或单时间点检测刺激前后荧光的强弱。DAF-FM-NO反应产物的荧光光谱和荧光素（Fluorescein）非常相似，可以用检测荧光素的参数设置进行检测，用检测FITC的参数设置进行检测也可以。

四、 其他说明

4.1 上述步骤推荐DAF-FM DA的工作浓度为5μM。对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000-1:5000的比例稀释DAF-FM DA，使装载探针时DAF-FM DA的工作浓度为1-2.5μM。相反，如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可以把DAF-FM DA的工作浓度为调整为10μM，以提高检测的灵敏度。

4.2 探针装载的时间可以根据情况在15-60min内适当进行调整。

注意事项：

1.      DAF-FM DA在4℃、冰浴等较低温度下会凝固而粘附在离心管管底、管壁或管盖内，可在25℃温育片刻直至完全溶解后再使用。

2.      第一次使用本品，请置于室温或25℃温育片刻直至完全溶解后，低速离心后，根据单次用量分成小包装后-20℃避光干燥保存，避免反复冻融。

3.      BSA和酚红对DAF-FM的荧光检测有干扰，请避免体系内含有这些组分。

4.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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