DAF-FM DA (5mM in DMSO)一氧化氮（NO）荧光探针

产品简介：

DAF-FM DA，也称为DAF-FM Diacetate，或4-Amino-5-Methylamino-2',7'-Difluorofluorescein Diacetate，是新一代用于检测和定量一氧化氮（Nitric oxide，NO）的荧光探针。具有细胞膜渗透性，无荧光。一旦进入细胞后，被细胞内的酯酶催化形成不具有膜渗透性的DAF-FM。DAF-FM本身仅有弱荧光，但和NO反应后可产生强烈荧光，最大激发波长为495nm，最大发射波长为515nm。任何可以检测荧光素的仪器都能检测，包括流式细胞仪、荧光显微镜、荧光酶标板和荧光计。

与传统的NO荧光探针—DAF-2 DA相比，DAF-FM DA具有以下重要优势：a）DAF-FM-NO加合物的光谱特性在pH 5.5以上不受pH影响；b）DAF-FM-NO加合物具有更显著的光稳定性，意味其提供更多的时间来捕捉图像；c）DAF-FM对NO的检测灵敏度更高，前者的检测下限~3nM；而DAF-2的检测下限~5nM。

本品以溶于DMSO的储存液形式提供，浓度为5mM。使用简单，只需用合适的生理缓冲液或培养基稀释到相应的工作浓度即可。建议起始工作浓度范围是1-10μM。

本品适合细胞内NO的检测，可以进行实时检测。若收集细胞后再装载探针，通常至少能检测100个样品。

产品特性

1） CAS NO.：254109-22-3

2） 化学名：3',6'-bis(acetyloxy)-4-amino-2',7'-difluoro-5-(methylamino)-spiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H] xanthen]-3-one

3） 英文同义名：DAF-FM Diacetate; 4-Amino-5-Methylamino-2',7'-Difluorofluorescein Diacetate; 3-Amino, 4- aminomethyl-2ʹ,7ʹ-difluorofluorescein Diacetate; Diaminofluorescein-FM diacetate;

4） 中文同义名：DAF-FM二乙酸盐；二氨基荧光素-FM二乙酸盐；4-氨基-5-甲氨基-2',7'-二氟荧光素二乙酸盐；3-氨基, 4-氨甲基-2ʹ,7ʹ-二氟荧光素二乙酸盐；

5） 分子式：C25H18F2N2O7

6） 分子量：496.42

7） 纯度：≥98%（HPLC）

8） 外观：无色至淡黄色溶液

9） Ex/Em：~495/515 nm (DAF-FM)

10）化学结构图：

保存条件: 

-20℃避光干燥保存，1年有效。

产品组成：

产品使用：

一、 工作液制备

取适量的母液用本试剂盒提供的稀释缓冲液或自行准备的新鲜培养基（不含血清和酚红）稀释到工作浓度，比如取5μl DAF-FM DA(5mM)按照1：1000的比例稀释到5ml DAF-FM DA(5μM)工作液，充分混匀。

【注意】工作液必须现配现用，实验结束后需丢弃多余探针。由于染料在水溶液中更容易氧化分解，为此，请尽快用完。

【注意】探针的最佳工作浓度需根据自身的细胞类型或实验条件来摸索，或参考文献。一般情况下，在保证获得足量荧光信号的前提下，尽量选择最小浓度的探针，这样可尽量减少酯的水解副产物如甲醛和乙酸的富集。

二、 探针装载

对于刺激时间较短（通常为2h以内）的细胞，先装载探针，后用适当的阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长（通常为6h以上）的细胞，先用适当的阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

2.1 探针原位装载（仅适用于贴壁细胞）

a）去除细胞培养液，加入适当体积准备好的DAF-FM DA工作液（比如按1：1000倍稀释后的工作液）。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入工作液体积为1ml。

b）37℃孵育20min。

c）用PBS, pH7.4洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA。

2.2 收集细胞后探针装载

a）细胞收集后，用适当体积准备好的DAF-FM DA工作液（比如按1：1000倍稀释后的工作液）重悬细胞，使得细胞浓度为一百万至二千万/毫升。

b）37℃孵育20min。以上操作可以在离心管内进行。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。c）用PBS, pH7.4洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA。

d）直接用适当的阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后再刺激细胞。

三、 荧光检测

3.1对于原位装载探针的样品：可以用激光共聚焦显微镜直接观察（用普通的荧光显微镜观察效果相对较差），或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

3.2 对于收集细胞后装载探针的样品：可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。

3.3 参数设置：使用495nm激发波长，515nm发射波长，实时、逐时间点或单时间点检测刺激前后荧光的强弱。DAF-FM-NO反应产物的荧光光谱和荧光素（Fluorescein）非常相似，可以用检测荧光素的参数设置进行检测，用检测FITC的参数设置进行检测也可以。

四、 其他说明

4.1 上述步骤推荐DAF-FM DA的工作浓度为5μM。对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000-1:5000的比例稀释DAF-FM DA，使装载探针时DAF-FM DA的工作浓度为1-2.5μM。相反，如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可以把DAF-FM DA的工作浓度为调整为10μM，以提高检测的灵敏度。

4.2 探针装载的时间可以根据情况在15-60min内适当进行调整。

注意事项：

1.      DAF-FM DA在4℃、冰浴等较低温度下会凝固而粘附在离心管管底、管壁或管盖内，可在25℃温育片刻直至完全溶解后再使用。

2.      第一次使用本品，请置于室温或25℃温育片刻直至完全溶解后，低速离心后，根据单次用量分成小包装后-20℃避光干燥保存，避免反复冻融。

3.      BSA和酚红对DAF-FM的荧光检测有干扰，请避免体系内含有这些组分。

4.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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