R-Phycoerythrin (PE) 藻红蛋白

产品简介：

R-藻红蛋白（PE）是从红藻中分离出来的。其主要吸收峰位于565nm，次要吸收峰位于496和545nm。不同类型的R-PE之间次级峰的相对突出程度存在明显差异。PE有三种类型的亚基：α（20000daltons）、β（20000daltons）和γ（30000daltons），PE的α亚基仅含有藻红蛋白（PEB）发色团，而β和γ亚基同时含有PEB和藻胆蛋白（PUB）。不同类型PE吸收光谱的可变性反映了亚基PEB/PUB比值的差异。PE和与B-PE是最强烈的荧光藻胆蛋白，量子效率可能超过90%，在任何中等浓度的溶液中，其橙色荧光都很容易被肉眼看到。

通常，当作为硫酸铵沉淀物冷藏储存时，藻胆蛋白具有良好的长期稳定性。纯化的胆脂蛋白可以在酸性或碱性条件下解离成亚基，但在室温下在中性pH下相对稳定，浓度大于0.1mg / mL。解离的亚基通常比天然色素的着色和荧光更低。建议将所有藻胆蛋白及其结合物（优选在中性缓冲溶液中）冷藏保存。

产品特性：

1）分子量：约240000

2）溶剂：水

3）Ex/Em：565/575

保存条件: 

4℃避光干燥保存，1年有效。

产品使用：（仅供参考）

PE与抗体的缀合实验方案

注1：整个缀合过程可以在一天内完成。但是，缀合前对PE的纯化可能需要24-48小时。除了下面列出的材料外，您还需要浓度至少为2 mg/ml 的抗体溶液。请您在进行PE抗体缀合实验之前熟悉如何使用脱盐柱以及如何获取吸光度光谱。

注2：SMCC-PE缀合物非常稳定（在“交换缓冲液”中，在 4℃下至少可以稳定几个月）。因此，如果您需要节省一部分时间，可以选择同时缀合10毫克或更多的PE，并将其用于几次抗体实验（在几周内）。SMCC-PE 的长期储存最好是作为饱和硫酸铵沉淀物。

一. PE的制备

1. 将PE纯化。缀合前的浓度通常为 5-10 mg/ml。注意：PE在缀合前作为SAS（硫酸铵钠）沉淀物最稳定。如果将PE以SAS沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。

2. 使用3.5毫克R-PE修饰每毫克IgG，包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。

3. 检查PE的纯度和浓度，请测量 280、565 和 620 nm 处的吸光度。（1 mg/ml的PE在 565nm处的OD为 8.2）。565/620 比率 > 50 表示已充分去除污染的藻蓝蛋白；565/280 比率 > 5 表示已充分去除所有其他蛋白质。

二. PE的活化

1. 使用前在无水DMSO中制备10 mg/ml的SMCC 储备溶液。

2. 每毫克PE加入11 µl SMCC，并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转 60 分钟。

3. 将纯化的PE过凝胶过滤柱来交换缓冲液。

注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少SMCC 相对于PE的量，可能会有所好转。

三. IgG还原

1. 在蒸馏水中制备1M DTT (15.4 mg/100 µl) 的新鲜溶液。

2. IgG溶液浓度应为4 mg/ml 或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行；MES、磷酸盐和TRIS缓冲液（pH范围为6至8）已被验证可以使用。如果抗体浓度低于2 mg/ml，则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加10%。

3. 用DTT配制20 mM IgG溶液：每毫升IgG溶液加入20 µl DTT 原液并搅拌。室温下静置 30 分钟，无需额外搅拌（以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸）。

4. 将还原的IgG通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含有大部分IgG的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。

5. 此步骤后尽快进行缀合。

注意：对于结合较差或失败的情况，降低DTT浓度可能会有所帮助。

四. 进行缀合

1. 每毫克IgG添加3.2毫克SMCC-PE。用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60分钟。

注意：这些摩尔比（每IgG约2个PE）效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所帮助。

2. 60分钟后，必须去掉IgG上未反应的游离巯基。

3. 在1.0 ml无水DMSO中制备10 mg NEM的新鲜溶液。

4. 每毫克 IgG 添加34 µg (3.4 µl)。室温下包裹并旋转20分钟。

注意事项：

1.      荧光染料都存在淬灭问题，操作或保存过程中尽量避光，减缓荧光淬灭。

2.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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