霍乱毒素B亚基

Cholera Toxin B subunit

产品简介：

霍乱毒素（Cholera toxin，CTX）是霍乱弧菌产生的毒力因子，会引起严重腹泻以及人体脱水。CTX属于AB5亚基家族。天然六聚体蛋白含两个亚基，分子量约85kDa。由一个A亚基（约27.2kDa）和五个B亚基（约11.6kDa/亚基）组成，B亚基以五聚体环的方式排列，呈明显的五度对称，负责毒素识别并吸附细胞表面的神经节苷脂GM1。A亚基催化刺激性G蛋白α亚基（Gαs）的ADP核糖基化，降低GTPase活性和活化α亚基。Gαs的活化引起腺苷酸环化酶（AC）活性增加，进而促使cAMP水平提高。A亚基还能ADP核糖基化视杆细胞外节膜盘的转运蛋白，使得GTPase失活。霍乱毒素还是一种高效的黏膜疫苗佐剂，通过抑制IL-12生产来诱导2型辅助性T细胞的免疫应答。

霍乱毒素B亚基（CTB）对细胞无毒，本质上不含腺苷酸环化酶活性。CTB通过结合神经节苷脂GM1附着到细胞上，是小胶质细胞的良好标记物（这类细胞表面富含神经节苷脂GM1），但不适合标记少突胶质细胞或星形胶质细胞。CTB是利用组化方法研究轴突运输的优秀示踪剂。CTB也是常用的脂筏标记物，脂筏是富含胆固醇和鞘脂的膜微区，在细胞信号转导和蛋白质运输中发挥重要作用。

本品以冻干粉形式提供，约含5%蛋白（Lowry-TCA）。

产品特性：

1）CAS NO：131096-89-4

2）同义名：Choleragenoid; CTB; CTxB；霍乱毒素B亚单位；

3）来源：霍乱弧菌

4）外观：白色至带黄色光泽的白色粉末

5）分子量：~11.8kDa

6）纯度：≥95%（SDS-PAGE）

7）内毒素：＜0.2EU /μg

8）溶解性：溶于水（10mg/ml）

9）活性测试：ELISA法检测神经节苷脂GM1包被的酶标板，加入兔抗CTB一抗和过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗。每ml结合液中加入0.05-1μg CTB达到50%饱和结合。

保存条件: 

-20℃保存，2年有效。

使用说明：

一、神经元逆行示踪剂

1.1、CTB试剂配制与储存

根据CTB粉末的量，加入相应体积的无菌1×PBS（PH7.4），配置成10 mg/mL（即1% w:v CTB溶液）的储存液，比如：1mg的CTB粉末加入100μL无菌1×PBS。重溶过程轻轻晃动瓶子，可适当轻柔涡旋混匀，避免剧烈震荡（防止蛋白结构破坏），同时避免用枪剧烈吹打液体，否则会产生泡沫。配好的储存液于-20至- 80°C分装保存，避免反复冻融。

1.2、动物手术与CTB注射

立体定位：将动物头部固定于立体定位仪上。

注射位点：目标核团（以CSF-contact nucleus为例），需提前根据脑图谱确定精确的三维坐标。

注射体积：0.2 μL。

注射浓度：1% CTB溶液。

注射工具：使用Hamilton微量注射器（33G针头） 连接微量注射泵进行控制。

注射速度：缓慢注射，全程约30分钟。

针头停留：注射完成后，针头在原位停留 10-15分钟，然后缓慢退出，以减少溶液沿针道回流。

1.3、灌注取脑与切片

存活期：注射后让动物存活 7-10天，以保证CTB被神经元充分摄取并逆向运输至胞体。

灌注固定：再次麻醉动物。先经心脏灌注 300 mL 预冷的 1×PBS（PH7.4）冲洗血液。紧接着灌注300 mL 4% 多聚甲醛（溶于1×PBS，pH 7.4） 进行固定。

取脑与切片：取出完整脑和脊髓，在冷冻切片机上进行冠状切片，片厚40 μm。收集切片于PBS或防冻液中备用。

1.4、免疫荧光染色

封闭与通透：使用含 0.3% Triton X-100的1×PBS（PH7.4）作为抗体稀释液和洗涤液，以通透细胞膜并减少非特异性结合。

一抗孵育：用抗CTB抗体（1:600稀释），将脑片在4°C下孵育 48小时。

二抗孵育：用荧光标记的二抗（1:200稀释），将脑片在室温下避光孵育 2小时。

细胞核复染：使用 DAPI 对细胞核进行染色，便于定位。

封片与观察：使用封片剂（比如：<NBS0032> 抗荧光淬灭封片剂）进行封片，在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。

1.5、图像采集与分析

采集：使用10×物镜观察并定位阳性神经元分布区域，使用40×物镜观察神经元细节形态。

分析：使用Image-Pro Plus等软件定量分析特定脑区内CTB阳性神经元的密度（个/0.2 mm²）。

三维重建：可将阳性神经元的位置信息在标准脑图谱上配准，使用Imaris等软件进行三维可视化重建。

二、免疫佐剂

2.1、溶液配置：据CTB粉末的量，加入相应体积的无菌1×PBS（PH7.4），配置成1 mg/mL的储存液，比如：1mg的CTB粉末加入1000μL无菌1×PBS。重溶过程轻轻晃动瓶子，可适当轻柔涡旋混匀，避免剧烈震荡（防止蛋白结构破坏），同时避免用枪剧烈吹打液体，否则会产生泡沫。配好的储存液于-20至- 80°C分装保存，避免反复冻融，正式实验前再用PBS稀释。

2.2、佐剂-抗原比例：可根据不同抗原类型调整，核心原则为“佐剂剂量不超过抗原剂量的1倍”（需预实验优化比例，混合溶液建议现配现用）。

2.3、使用浓度与剂量（以口服免疫为例）：单只小鼠单次剂量：10μg /只（文献报道与15μg HA 的 H9N2 WIV 联合免疫）。按 100μL/只 给药体积计算，CTB 终浓度为 100μg/mL。免疫间隔：0 天、7 天、14 天（共 3 次免疫）。

三、脂筏标记

细胞膜脂筏的标记可以使用CTB& CTB一抗& 荧光二抗 来实现，标记方法可参考1.4，但不能进行通透处理，也可以直接使用荧光标记的CTB（比如：<NBS6723> Recombinant Cholera Toxin B subunit, CF488A-conjugated 重组霍乱毒素B亚基）进行标记，方法如下：

以下方案适用于对 1 个 2 mL 体系、浓度为 1×10⁶个/mL 的悬浮活细胞样本进行标记。对于在 18 mm×18 mm 盖玻片上生长至亚汇合度（70%-80%）的贴壁细胞，也可使用相同体积的试剂进行标记。若需标记多个样本，可按比例扩大试剂用量；若孵育体积小于 2 mL，可按比例减少试剂用量。

3.1、细胞洗涤：将细胞离心，用预冷的1×PBS（PH7.4）轻轻重悬细胞沉淀。

3.2、CTB孵育条件

浓度优化：荧光标记的CTB推荐工作浓度5-10μg/mL（不同细胞类型最适浓度有差异，需预实验确定，过高浓度增加背景），工作液可用无菌1×PBS稀释（PH7.4）。

孵育时间与温度：4°C孵育30分钟（减少内吞作用，保持膜表面GM1标记）。若需标记内化GM1，可改为 37°C孵育15-30分钟。孵育结束后，用预冷的1×PBS（PH7.4）轻轻洗涤细胞数次。

避光操作：荧光标记的CTB对光敏感，全程避光。

3.3、封片与观察标记细胞

若细胞无需用醛类固定以进行长期储存，也无需固定后用去污剂透化以进行后续标记步骤，则可直接进行此步骤；否则跳过此步骤，继续进行步骤 3.4。将细胞置于预冷的1×PBS（PH7.4）中封片，使用合适的滤光片组通过荧光显微镜观察细胞。

3.4、固定（可选）：将细胞置于含 4% 甲醛的预冷1×PBS（PH7.4）中，在 4°C 条件下固定 15 分钟，避免醛类过度交联破坏脂筏结构。甲醇/丙酮等有机溶剂固定会溶解脂筏，不可使用。若细胞无需去污剂透化，可直接进行步骤3.6。

洗涤：固定后用1×PBS（PH7.4）轻柔洗涤3次，防止脂筏破坏。

3.5、透化细胞（可选）：脂筏的标记不建议透化处理，如实验中无法避免透化，可尝试将固定后的细胞置于含 0.1% Saponin的1×PBS（PH7.4）中，在室温下透化 10 分钟。透化结束后，用 1× PBS 洗涤细胞 1 次。

3.6、封片与观察固定后的细胞：使用封片剂（比如：<NBS0032> 抗荧光淬灭封片剂）对固定后的细胞（或固定并透化后的细胞）进行封片，然后使用合适的滤光片组通过荧光显微镜观察细胞。

注意事项：

1.      本品不含防腐剂NaN3，需执行严格的无菌操作。

2.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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