双萤光素酶报告基因检测试剂盒

Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit
 

产品简介：

双萤光素酶报告基因检测试剂盒（Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit）是一种高效的检测工具。它首先利用萤光素（luciferin）作为底物，检测萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase）的活性；随后，以肠腔素（coelenterazine）作为底物，检测海肾萤光素酶（Renilla luciferase）的活性。在加入海肾萤光素酶底物的过程中，试剂盒会同时添加一种抑制剂，用于抑制萤火虫萤光素酶对luciferin的催化发光反应，从而确保后续检测仅针对海肾萤光素酶的活性，实现精准的双萤光素酶报告基因检测。

萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61 kD的蛋白质，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，能够催化luciferin氧化生成oxyluciferin，并在此过程中发出生物萤光（bioluminescence）。海肾萤光素酶则是一种分子量约为36 kD的蛋白质，在氧气存在的条件下，可以催化coelenterazine氧化生成coelenteramide，同时发出生物萤光。这种生物萤光可以通过化学发光仪（luminometer）或液闪测定仪进行精确测量。

萤火虫萤光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560 nm，而海肾萤光素酶催化coelenterazine发光的最强发光波长为465 nm。在实际应用中，通常将目标基因的5´UTR（非翻译区）或启动子序列克隆至萤火虫萤光素酶基因的上游，或将3´UTR克隆至其下游，通过检测萤火虫萤光素酶的表达量来评估启动子或调控元件的转录调控作用。与此同时，海肾萤光素酶（Renilla Luciferase）被用作内参，用于校正细胞数量或转染效率的差异，从而确保实验结果的准确性和可靠性。

保存条件: 

-20℃保存（一年有效）

产品组成： 

注意：

1. 细胞裂解液、萤火虫荧光素酶检测缓冲液、Renilla 荧光素酶检测缓冲液在4℃可以保存一个月，-20℃可以保存一年，-80℃可以长期保存。

2. 萤火虫荧光素酶检测底物、Renilla 荧光素酶检测底物，-20℃可以保存半年，-80℃可以保存一年。

产品使用：

1. 细胞裂解：

根据不同的细胞培养板加入适量的细胞裂解液：

1) 对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后用1×PBS润洗2遍后，去除洗涤液，然后加入细胞裂解液，使裂解液完全覆盖细胞；对于悬浮细胞：离心去上清后用1×PBS润洗2遍后离心去上清，加入细胞裂解液。

2) 于振荡器上室温裂解20min以裂解充分，然后10000-15000g离心3-5min，取上清用于测定。

注意：

a) 裂解产物可室温保存6h，-70℃可长期存放（裂解产物不能反复冻融）；

b) 如果萤光素酶的表达水平较低，可以尝试使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以最小为100μl；

c) 细胞裂解后可以立即测定荧光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。

2. 工作液准备

将所有组分平衡至室温。

1) 萤火虫萤光素酶工作液制备

a) 配置10mg/mL萤火虫萤光素酶储存液。2mg萤火虫荧光素酶检测底物（NBS0555-C）溶解在200μl超纯水中。储存液-20℃可以储存6个月，反复冻融5次。

b) 工作液配置：用萤火虫荧光素酶检测缓冲液（NBS0555-B）按照1:50稀释以上储存液，配制成0.2mg/ml的萤火虫萤光素酶工作液。

注意：萤火虫萤光素酶工作液不能反复冻融超过5次，若单次实验用量较少，建议按单次使用量分装成小规格。

2) Renilla荧光素酶工作液制备

a) 配置2mg/ml Renilla荧光素酶储存液。400μg Renilla 荧光素酶检测底物（NBS0555-E）溶解在200μl无水乙醇中。储存液-20℃可以储存3个月，反复冻融5次。

b) 工作液配置：用Renilla 荧光素酶检测缓冲液（NBS0555-D）按照1:50稀释以上储存液，配制成0.04mg/ml的Renilla荧光素酶工作液。

3. 检测

1) 取样品20-100μl（如果样品量足够，请加入100μl；如果样品量不足可适当减少用量，但检测孔用量需保持一致）。细胞裂解液为空白对照。

2) 加入100μl萤火虫萤光素酶检测液，用枪吹打均匀或用其它适当方式混匀后测定RLU（relative light unit）值。

注意：由于该发光为瞬时发光，建议加入萤火虫萤光素酶工作液后，立即进行检测。

3) 加入100μl Renilla荧光素酶工作液，用枪吹打均匀或用其它适当方式混匀后测定RLU（relative light unit）值。

4. 计算

在以Renilla荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值除以Renilla荧光素酶测定得到的RLU值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。

注意事项：

1. 荧光染料操作中注意避光进行。

2. 为保证荧光素酶检测试剂的稳定性，可以采取适当分装后避光保存的方法，以避免反复冻融和长时间暴露于室温。

3. 萤火虫荧光素酶检测试剂、Renilla 荧光素酶检测试剂最好现用现配。

4. 细胞裂解液及裂解时间可根据细胞量适当增加、延长。

5. 关于检测仪器的选择：能够检测化学发光或者生物发光的仪器都可适用于此试剂盒。如果使用多功能酶标仪，为防止各孔之间的干扰，jnh官网推荐使用黑色酶标板（NBH3050），并且不同实验组之间最好有间隔。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。