TRIzol Reagent 总RNA提取试剂

TRIzol Reagent 总RNA提取试剂

产品描述

TRIzol Reagent是一种即用型且操作迅捷的总RNA抽提试剂，适用样本广泛，包括人、动物、植物、酵母或细菌来源的细胞和组织样本。TRIzol Reagent是一种含酚、异硫氰酸胍和其他专利成分的单相溶液，有利于抽提分子量大小不一的各种RNA类型。TRIzol Reagent能够良好的维持RNA完整性，因能高效抑制样本匀浆过程中细胞破损和细胞组分溶解时释放的RNase活性。TRIzol Reagent能够同时处理大量样本，且以优化的方式一步法提取RNA，整个过程可在一小时内完成。

TRIzol Reagent分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，适用于RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、poly(A)+筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆等下游实验。

保存与运输方法

保存：2-8℃保存，至少一年有效。

运输：冰袋运输。

注意事项

1）   所有离心管、枪头以及相关溶液都必须无RNase污染。对于塑料制品、玻璃和金属器皿、实验仪器等可使用固相RNase清除剂去除RNase，或者用含0.01% DEPC的去离子水浸泡过夜，之后高压灭菌、烘干。对于实验溶液可使用液相RNase清除剂来处理或用DEPC处理水来配制。

2）   对新鲜组织或细胞样本的抽提效果通常优于冻存的组织或细胞，由于组织或细胞冻融过程中可能存在一些RNase释放出来并酶切样品。若是不能及时提取RNA，推荐先加入适量TRIzol Reagent，之后裂解样品后再冻存。

3）   TRIzol Reagent含有毒物质，请在操作过程中注意好防护工作，戴好手套和护眼罩，避免皮肤接触。在通风橱内完成操作，避免呼吸道吸入。

4）  为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1.  需要自行准备的材料

水浴锅或微量恒温仪（Heat block）

异丙醇

75%乙醇

含0.5% SDS的RNase-free水或RNase-free水或DEPC处理水

【可选】RNase-free的糖原（核酸助沉剂）

2.  样本要求

【重要】：样本收集后立即进行RNA分离，或样本收集后立即冻存样本并保存在-80℃或液氮中直至RNA提取。

3. 样本准备与分相

3.1 根据起始材料用TRIzol Reagent裂解和匀浆样本。

◇组织样本

按比例每50~100mg 组织加1ml TRIzol Reagent，之后用合适的方法进行匀浆。通常用50~100mg组织即可获得足量的RNA，满足绝大多数下游实验。加入过量组织或过少TRIzol都容易导致RNA提取失败。

a）对于研钵研磨：将液氮冻存组织，放到研钵中研磨成粉末，之后加入1ml TRIzol，继续研磨至组织完全裂解【研磨要迅速，最好不要超过1min】。

b）对于玻璃匀浆器匀浆：加入1ml TRIzol上下手动匀浆组织10~15次。

c）对于机械匀浆器：将组织放入塑料管内，将塑料管置于冰浴烧杯内，加入1ml TRIzol，将分散器头垂直插入管内与组织直接接触，设置转速12,000~20,000 rpm，上下移动试管10~20次，直至组织完全打散，无明显可见大块即可。

◇单层生长的细胞

吸尽培养基，之后往35mm培养皿（10cm²）内加入1ml TRIzol Reagent，晃动3~5次，再用移液枪上下吹打3~5次，使其充分裂解。【按照10cm²培养面积加入1ml TRIzol加量。比如：六孔板每孔加入1ml TRIzol，12孔板每孔加0.5ml TRIzol】

◇  悬浮生长的细胞

离心收集细胞，吸尽上清，每5-10×10⁶个细胞（动植物或酵母来源）或1×10⁷个细胞（细菌来源）加入1ml TRIzol Reagent【加入TRIzol前不要清洗细胞，否则会增加mRNA降解的可能性】。用枪吹打几次或适当涡旋，使其充分裂解。某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，使其完全裂解。

【注意】：样本体积不要超过加入TRIzol体积的10%。 

3.2 特殊样本处理【可选】：对于某些富含蛋白，多糖或脂肪的样本，经TRIzol Reagent裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物出现。此时需12,000g 4℃离心10min，之后吸取澄清的上清液至一新的离心管中。

3.3 室温孵育5min，使得核蛋白体完全分解。

3.4 按照每1ml TRIzol Reagent加入0.2ml 氯仿，盖紧盖子。涡旋混匀或用手剧烈晃动15s，室温孵育2~3min。

3.5 于12,000g 4℃离心15min。离心后混合物分为三层：下层酚-氯仿层，中间层，和上层无色的水相层。RNA无一例外的停留在水相层中。水相层的容量约为所加TRIzol Reagent体积的60%。用枪吸取上层无色水相到一新的离心管中，避免吸到任何中间层或下层成分。

【注意】：如果希望分离DNA和蛋白，请保留中间层和有机层。

4.      RNA分离

4.1    RNA的沉淀：

a）【可选】如果起始样本量比较少（＜10⁶个细胞或＜10mg组织），加入5-10μg RNase-free的糖原作为核酸助沉剂到水相中。

b）按每ml起初TRIzol Reagent加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10min。如果希望提取microRNA等小RNA，推荐-70℃沉淀过夜。c）于12,000g 4℃离心10min，在管底可见RNA沉淀，弃上清。

4.2    RNA的清洗：

a）按每ml起初TRIzol Reagent加入1ml 75%乙醇重悬沉淀。【注：RNA在75%乙醇中-20℃至少保存1年，4℃至少1周】；

b）低速漩涡或颠倒混匀，于7,500g 4℃离心5min，弃上清。再用离心机甩一下（>5,000rpm, 离心1秒），小心吸尽液体。

c）操作的最后，简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5~10min）。不要在真空管里离心干燥RNA。尤为重要的是，不能让RNA沉淀完全干燥，否则会极大的降低其可溶性。部分溶解的RNA样本的A260/A280比值＜1.6。

4.3    RNA的溶解：用20~50μl 无RNases水或含0.5% SDS的无RNases水溶解RNA，用枪上下吹打2~3次，使其充分溶解，置于-70℃保存或直接用于后续实验，如果后续要做酶切反应请勿用SDS。

【注意】：对于肝脏、胰腺、肾脏等RNase含量较高的组织，沉淀可用100%去离子甲酰胺溶解。

5.      RNA产量的测定

5.1    用无RNase水稀释RNA，之后测定在260nm和280nm的吸收值。

5.2    使用公式A260×稀释倍数×40= μg RNA/ml。

5.3    计算A260/A280比值，比值在1.8~2.0之间视为纯度较高，浓度＞4 μg/ml的样品适用于分光光度计测定。

5.4    进行甲醛变性琼脂糖电泳，确定RNA的完整性和污染情况。